美國清醒動物多光子顯微鏡實驗

Ca2+是重要的第二信使，對于調節細胞的生理反應具有極其重要的作用，開發和利用雙光子熒光顯微成像技術對Ca2+熒光信號進行觀測，可以從某些方面對有機體或細胞的變化機制進行分析，具有重要的意義。利用雙光子熒光顯微成像技術可以觀察細胞內用熒光探針標記的Ca2*的時間和空間的熒光圖像的變化，還可以觀察細胞某一層面或局部的（Ca2+）熒光圖像和變化。通過對單細胞的研究發現，Ca2+不僅在細胞局部區域間的分布是不均勻的，而且細胞內各局部區域的不同深度或層次間也存在不同程度的Ca2+梯差即所謂的空間Ca2梯差。多光子顯微鏡在臨床前評價IA形態、細胞外基質、細胞密度和血管形成等方面顯示出強大的作用。美國清醒動物多光子顯微鏡實驗

當細胞受到外界刺激時，隨著刺激時間的增加，即使繼續刺激，Ca2+熒光信號也不會繼續增強，反而會減弱，直至恢復到無刺激時的水平。對于細胞受精過程中Ca2+熒光信號的變化，發現粘附過程中Ca2+熒光信號沒有變化，但當配子融合時，Ca2+熒光信號強度出現一個不穩定的峰值，持續數分鐘。這些現象對于研究受精發育的早期信號以及Ca2+在卵子和受精卵發育中的作用具有重要意義。在其他生理過程中，如細胞分裂和胞吐，Ca2+熒光信號的強度也會發生很大的變化。美國離體多光子顯微鏡長時間觀察多光子顯微鏡適用于動物大腦皮層深層（400微米）細胞的形態、生理學研究。

以往我們認識的光電效應是單光子光電效應，即一個電子在極短時間內能吸收到一個光子而從金屬表面逸出。強激光的出現豐富了人們對于光電效應的認識，用強激光照射金屬，由于其光子密度極大，一個電子在短時間吸收多個光子成為可能，從而形成多光子電效應，這已被實驗證實。為什么一般討論的光電效應都是指單光子光電效應呢？這是因為，在使用普通光源的情況下，電子吸收兩個以上光子能量的概率是非常非常小的，幾乎為零。事實上，愛因斯坦本人就考慮過在強光下發生光電效應的可能性問題。對此，他有如下的論述：光電效應中的一個電子吸收兩個光子的幾率不會大于下雨天兩個雨滴同事打在一個螞蟻上的幾率。因此，多光子光電效應在實驗上的研究成為可能，是二十世紀六十年代激光乃至強激光出現以后的事情。有了激光，對于雙光子光電效應，在實驗上和理論上均取得了許多成果。利用強激光，人們不僅觀察到雙光子和三光子的光電效應，甚至觀察到金靶材吸收幾十個等效光子實驗現象。

比較兩表格中的相關參數可以看出，基于分子光學標記的成像技術已經在生物活檢和基因表達規律方面展示了較大的優勢。例如，正電子發射斷層成像（PET）可實現對分子代謝的成像，空間分辨率∶1-2mm，時間分辨率;分鐘量級。與PET比較，光學成像的應用場合更廣（可測量更多的參數，請參見表1-1），且具有更高的時間分辨率（秒級），空間分辨率可達到微米。因此，二者相比，雖然光學成像在測量深度方面不及PET，但在測量參數種類與時空分辨率方面有一定優勢。對于小動物（如小白鼠）研究來說，光學成像技術可以實現小動物整體成像和在體基因表達成像。例如，初步研究表明，熒光介導層析成像可達到近10cm的測量深度;基于多光子激發的顯微成像技術可望實現小鼠體內基因表達的實時在體成像。未來國產多光子激光掃描顯微鏡替代空間大。

多光子激光掃描顯微鏡的產業發展，世界多光子激光掃描顯微鏡產業主要分布在德國和日本，德國以徠卡顯微系統和蔡司為基礎，日本以尼康和奧林巴斯為基礎。2020年以來，這些企業占據了全球多光子激光掃描顯微鏡市場的64.44%，它們的發展策略影響著多光子激光掃描顯微鏡市場的走向。目前，世界市場對多光子激光掃描顯微鏡的需求正在增長，中國市場的需求增長更快。未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場的發展在中國將仍有巨大的發展潛力。多光子顯微鏡能提供多種對比度機制。Ultima Investigator多光子顯微鏡數據處理

多光子顯微鏡可以進行深層成像，且具有三維成像的能力，可以應用于拍攝不透明的厚樣品。美國清醒動物多光子顯微鏡實驗

在多光子顯微鏡（也稱為非線性或雙光子顯微鏡）中，以兩倍正常激發波長照射樣品。更長的波長是有利的，因為它們可以更深地穿透樣品進行3D成像，并且因為它們不會損壞樣品，從而延長樣品壽命。為了實現多光子激發，照明光束在空間上聚焦（使用光學器件），同時使用高能短脈沖激發光束以提高兩個（或更多）光子同時到達同一位置（即熒光團分子）的概率。多光子顯微技術的例子包括二次諧波產生(SHG)、三次諧波產生(THG)、相干反斯托克斯拉曼光譜(CARS)和受激發射耗盡(STED)顯微技術。由于這些技術中的每一種都使用脈沖激光器，因此選擇能夠比較大限度地減少脈沖色散的光學組件很重要，并且激光反射二向色鏡應具有低GDD特性。美國清醒動物多光子顯微鏡實驗