美國清醒動物多光子顯微鏡多光子激發

單光子激發熒光和雙光子激發熒光，是從熒光產生的機理上來區分的。而共焦則是熒光顯微鏡的一種結構，其目的是為了，通過共焦結構，提高整個熒光顯微鏡的空間分辨率。所以共焦熒光顯微鏡可以根據激發光源的不同，實現單光子共焦熒光成像或者雙光子共焦熒光成像。往往一個普通的雙光子熒光顯微鏡（沒有共焦結構）其空間分辨率也可以達到單光子共焦熒光顯微鏡的水平。這樣就可以簡化整個系統，相對來說，就提高了激發光源的利用率，以及熒光的探測效率，這個也是我們提倡雙光子熒光成像的原因之一。雙光子熒光共焦顯微鏡由于雙光子效應和共焦結構，分辨率則會更高，而我們通常說的共焦顯微鏡都是指單光子激發熒光的。生產和消費的角度分析多光子顯微鏡的主要生產地區、主要消費地區以及主要的生產商。美國清醒動物多光子顯微鏡多光子激發

2020年，JianglaiWu等人提出提高2PM橫向掃描速率的裝置，稱為FACED（free-spaceangular-chirp-enhanceddelay）。圓柱透鏡將激光束一維聚焦，會聚角為Δθ。光束進入到一對幾乎平行的高反射鏡中，其間距為S，偏角為α。經過反射鏡多次反射后，激光脈沖被分成多個傳播方向不同的子脈沖（N=Δθ/α），脈沖間以2S/c的時間延遲（c，光速）回射。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列。然后將該模塊并入具有高速數據采集系統的標準雙光子熒光顯微鏡中。光源是具有1MHz重復頻率的920nm的激光器，通過FACED模塊可產生80個脈沖焦點，其脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像，虛擬源越遠，物鏡處的光束尺寸越大，焦點越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm。美國高速高分辨率多光子顯微鏡研究多光子顯微鏡市場集中，由于投產生產的成本較高，技術難度大，目前涌現的新企業不多。

與傳統的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡具有光學切片和深層成像等功能，這兩個優勢極大地促進了研究者們對于完整大腦深處神經的了解與認識。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經元成像、大量神經元成像、高速神經元成像這三個方面論述了相關的MPM技術。想要將神經元活動與復雜行為聯系起來，通常需要對大腦皮質深層的神經元進行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發和發射光會被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過增加激光強度來解決散射問題，但這會帶來其他問題，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長的波長作為激發光。

2020年，TonmoyChakraborty等人提出了加速2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學顯微鏡中，物鏡或樣品緩慢的軸向掃描速度限制了體成像的速度。近年來，通過使用遠程聚焦技術或電調諧透鏡(ETL)已經實現了快速軸向掃描。但遠程對焦時對反射鏡的機械驅動會限制軸向掃描速度，ETL會引入球差和高階像差，無法進行高分辨率成像。為了克服這些限制，該小組引入了一種新的光學設計，可以將橫向掃描轉換為無球面像差的軸向掃描，以實現高分辨率成像。有兩種方法可以實現這種設計。***個可以執行離散的軸向掃描，另一個可以執行連續的軸向掃描。如圖3a所示，特定裝置由兩個垂直臂組成，每個臂具有4F望遠鏡和物鏡。遠程聚焦臂由振鏡掃描鏡(GSM)和空氣物鏡(OBJ1)組成，另一個臂(稱為照明臂)由浸沒物鏡(OBJ2)組成。兩個臂對齊，使得GSM與兩個物鏡的后焦平面共軛。準直后的激光束經偏振分束器反射進入遠程聚焦臂，由GSM進行掃描，使OBJ1產生的激光焦點可以進行水平掃描。世界多光子激光掃描顯微鏡產業主要布局在德國和日本，德國是徠卡顯微系統和蔡司。

當細胞受到外界刺激時，隨著刺激時間的增加，即使繼續刺激，Ca2+熒光信號也不會繼續增強，反而會減弱，直至恢復到無刺激時的水平。對于細胞受精過程中Ca2+熒光信號的變化，發現粘附過程中Ca2+熒光信號沒有變化，但當配子融合時，Ca2+熒光信號強度出現一個不穩定的峰值，持續數分鐘。這些現象對于研究受精發育的早期信號以及Ca2+在卵子和受精卵發育中的作用具有重要意義。在其他生理過程中，如細胞分裂和胞吐，Ca2+熒光信號的強度也會發生很大的變化。目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡。模塊化多光子顯微鏡成像精度

光子顯微成像技術不是什么新技術，早在20多年前就有了，目前已經在生命科學和材料科學中廣泛應用。美國清醒動物多光子顯微鏡多光子激發

對于雙光子成像而言，離焦和近表面熒光激發是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數量級的脈沖能量才能獲得與2P激發的相同強度的熒光信號。功能性3P顯微鏡比結構性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時采樣神經元活動；需要更高的脈沖能量，以便在每個像素停留時間內收集足夠的信號。復雜的行為通常涉及到大型的大腦神經網絡，該網絡既具有局部的連接又具有遠程的連接。要想將神經元活動與行為聯系起來，需要同時監控非常龐大且分布普遍的神經元的活動，大腦中的神經網絡會在幾十毫秒內處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經元動力學，就需要MPM具備對神經元進行快速成像的能力。快速MPM方法可分為單束掃描技術和多束掃描技術。美國清醒動物多光子顯微鏡多光子激發