國內激光熒光雙光子顯微鏡熒光探測

2020年12月22日，臨研所、病理科和科研處邀請北京大學王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統介紹及其在臨床醫療診斷”的學術報告。學術報告由臨研所醫學實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民，北京大學信息科學技術學院副教授，畢業于北京大學物理系，獲學士、碩士學位，后于英國巴斯大學物理系獲博士學位。該研究組研發的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經元和神經突觸清晰穩定的動態信號，該成果獲得了2017年度“中國光學進展”和“中國科學進展”，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術在臨床診斷中的應用，為未來即時病理、離體組織檢測、術中診斷等提供新的影像手段和分析方法。雙光子顯微鏡有哪些應用呢？國內激光熒光雙光子顯微鏡熒光探測

雙光子顯微成像技術不是什么新技術，早在20多年前就有了，目前已經在生命科學和材料科學中廣泛應用。幾年前雙光子**過期后，已經推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計不少于10家以上。即便如此，世界上很多實驗室都搭雙光子，自己搭的好處有很多，首先是便宜，尤其是實驗室已經有飛秒激光器，那就更很省錢了。其次是靈活，可以選擇針對特殊用途的搭配，改動也靈活。結束后的好處就是可以鍛煉隊伍，一趟走下來可以把新手帶出來，后期維護也更加自由。當然壞處也不少，首先是操心，特別是第1次搭的時候，開始要想方案，后來要解決各種實際問題。其次是花時間，加上買配件的時間，比買一臺現成的商業化雙光子耗時長。現在已經有不少關于如何搭雙光子顯微鏡的文章，各種protocol，大多是老外寫的，中文的較少。其實完全自己搭一套好用的系統還是不容易的，尤其是沒有經驗的時候，容易走彎路，多花錢，也多花時間，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買，在國內買這些東西耗時較長。因此，我想總結一下我們的經驗，貼出來分享，希望能幫到想自己動手的實驗室國內激光雙光子顯微鏡授權商雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器。

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間后，發射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的。雙光子激發需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有100飛秒，而其周期可以達到80至100兆赫茲。在使用高數值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時，物鏡的焦點處的光子密度是比較高的，雙光子激發只發生在物鏡的焦點上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦，提高了熒光檢測效率。

TOPTICAFemtoFiberultra920超快光纖激光器是一種易于操作且無需維護的激光系統。其輸出波長為920nm，非常適合常規熒光基團（如GFP，eGFP，Eosin，GCaMP，CFP，Calcein或者Venus）的雙光子激發。能給熒光基團提供比較高的峰值功率，常用于神經科學和其他與激光有關的生物光子學學科。而且其獨特設計（制造簡單且經濟高效的光源）對雙光子熒光顯微鏡發展的革新具有潛在的可能。在雙光子顯微鏡中，峰值功率就是亮度！如果您希望獲得比較好的圖像亮度，那么你就需要短脈沖，高功率，較重要的是需要干凈的時間脈沖形狀。FemtoFiberultra920具有足夠高的輸出功率，較短的脈沖和獨特的Clean-Pulse技術，以及具有相對比較高的峰值功率，使得其在雙光子顯微鏡中可以實現****的亮度，而不會對樣品造成不必要的加熱。FemtoFiberultra920交鑰匙，完全集成的色散補償（可確保樣品處的脈沖較短），內置的功率控制，操作直觀以及其堅固而緊湊的設計，使該系統具有極為友好的用戶體驗，是非線性顯微鏡應用的較好解決方案。例如熒光蛋白的雙光子激發和基于SHG的對比機制。雙光子顯微鏡型號有哪些？

利用鈣成像技術記錄大腦活動，隨著功能光學成像技術的發展，神經學家們已經可以研究腦區和神經元內部的工作情況。功能鈣成像技術就是其中之一，其主要原理是將外源性熒光信號和生理現象耦合起來——通過熒光染料信號的改變反映細胞內游離鈣離子濃度，以此細胞的功能狀態。目前它被廣泛應用于實時監測一群相關神經元內鈣離子的變化，從而判斷其功能活動。該技術的出現使得科學家可以親眼目睹神經信號在神經網絡之中時間和空間上的傳遞穿梭。雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被發動，所以雙光子成像更清晰。進口ultimainvestigator雙光子顯微鏡掃描深度

這種雙光子顯微鏡的視場是普通顯微鏡的10倍。國內激光熒光雙光子顯微鏡熒光探測

雙光子顯微鏡的應用由于適合動態成像，雙光子顯微鏡一經問世便很快應用于神經科學、遺傳發育、藥物代謝等領域。雙光子顯微鏡能夠在細胞甚至是亞細胞水平上對***神經細胞的形態結構、離子濃度、細胞運動、分子相互作用等進行直接成像監測，而且能夠進行光裂解、光轉染和光損傷等光學操縱。同時，雙光子顯微鏡能動態監測**在體內的生長和轉移，并可對**治療過程中*細胞的變化進行實時觀測和評估。隨著光學技術、熒光探針技術、計算機成像技術的發展，雙光子顯微技術會得到更大提升和更廣的應用，未來不僅用于基礎研究，也將擴展到臨床應用。國內激光熒光雙光子顯微鏡熒光探測