熒光染料:能發出熒光的染料。在吸收紫外線或可見光后,能把短波長的光轉變為波長較長的可見光波而反射出來,呈閃亮的鮮艷色彩。例如,酸性曙紅、熒光黃、紅汞以及某些分散染料等。它們大多是含有苯環或雜環并帶有共軛雙鍵的化合物。熒光染料可以單獨使用,也可以組合成復合熒光染料使用。其中復合熒光染料是利用熒光共振能量轉移技術合成的熒光染料,由距離非常近、能量可以在彼此間傳遞的一個供體及一個受體熒光物分子所組成。復合染料在受體分子的激發波長被激發,在供體分子的發射波長發射一個光子。熒光染料發展非常迅速,已開發的用于科研和臨床應用的熒光染料已基本覆蓋了由紫外到可見光及紅外的整個光譜范圍。異硫氰酸熒光素(FITC) 是一種有機熒光染料,目前,這種熒光染料仍用于免疫熒光和流式細胞術中。免疫組化熒光染料luc
為什么要使用熒光染料?雖然不同的染色技術(即考馬斯染色、銀染色、熒光染色)可用于可視化凝膠電泳分離的蛋白質,但使用熒光染料具有其獨特的優勢。他們提供:高靈敏度:對于大多數分析物,熒光測量的靈敏度比吸光度測量高1000倍,即使在使用小樣本時也可以令人滿意地達到ppt(萬億分之一)的檢測限。寬線性動態范圍。輸出與樣品濃度成正比。低干擾:由于吸收光的材料數量眾多,分光光度測量通常會遇到干擾問題。在進行熒光測量時不會遇到這個問題,因為只有少數材料具有熒光能力。高通量:熒光測量具有簡單而強大的協議,并且可以自動化用于高通量應用。海南ivis熒光染料熒光染料可以單獨使用,也可以組合成復合熒光染料使用。
CY7是一種CY染料。CY為花菁(Cyanine)的縮寫,是由奇數個甲基單元連接的兩個氮原子組成的化合物。菁類化合物具有波長長、吸收和發射可調、消光系數高的特點CY系染料常被用于蛋白、抗體以及小分子化合物的標記,對于蛋白抗體的標記,可以通過簡單的混合反應來完成結合,下面我們介紹了蛋白抗體標記的標記方法,具有一定的參考意義。一、比較好蛋白制備1)為獲得標記效果,請制備蛋白(抗體)濃度為2mg/mL。2)蛋白溶液的pH值為8.5±0.5。如果pH值低于8.0,應使用1M3)如果蛋白濃度低于2mg/mL,標記效率會**降低。為獲得比較好標記效率,建議**終蛋白濃度范圍為2-10mg/mL。4)蛋白必須在不含伯胺(如Tris或甘氨酸)的緩沖液中,和銨離子,否則會影響標記效率。2.染色制備(以CY3-NHS酯為例)將無水DMSO加入CY3-NHS酯小瓶中,制備成10mM儲備液。通過移液器或渦旋混合均勻計算。使用前需先使用縮合液(500μg/mL)(HY-D0178)活化另一個可進行后續標記實驗。
第二種***使用的DNA染色方法是Hoechst染料,**初由化學公司HoechstAG生產。Hoechst33258、Hoechst33342和Hoechst34580都是鄰苯二甲酰亞胺,具有向A-T富集區插入的趨勢,因此后者不常使用。與DAPI相似,此類染料受到紫外線激發并在455nm下發射比較大值,在無結合狀態下變為510–540nm。Hoechst染料還具有細胞滲透作用,因此可用于固定細胞和活細胞。與DAPI不同是,Hoechst染料毒性更低。DNA染色劑碘化丙啶無法透過細胞膜。在細胞培養中,因為該染色劑無法進入完好的細胞內,所以常常被用來區分活細胞和死細胞。碘化丙啶也是一種結合劑,但對不同的堿基沒有特異性。在核酸結合態下,其比較大激發波長為538nm,比較高發射波長為617nm。未結合狀態下碘化丙啶的比較大激發和發射被移到較短的波長和較弱的強度。它也可以在不改變其熒光特性的情況下與RNA結合。要區分DNA和RNA,必須使用足夠的聚合酶。DiD,DiO,DiI,DiR和DiS染料是一族親脂性的熒光染料,可以用來染細胞膜和其它脂溶性生物結構。
SuperFluor活化酯(與Invitrogen的AlexaFluor活化酯完全相同)SuperFlour系列熒光探針,具有更強的熒光強度,更廣的pH應用范圍(pH4~10),更好的抗淬滅性。在生物熒光領域已逐漸替代FITC,Cy3,Cy5,Cy5.5,Cy7等熒光染料。1.標記效率低——計算結果顯示每摩爾145,000MW的蛋白標記的熒光團少于4mol有以下原因:1)緩沖液中含有痕量伯銨成分,與染料反應降低了標記效率。如果蛋白已經溶于含氨基的緩沖液(如Tris或氨基乙酸),標記前用PBS透析。2)蛋白含量較低(≤1mg/mL)會影響標記效率。3)標記步驟中加入碳酸氫鈉的作用是將反應混合物的pH升高至~8,因為在弱堿性環境中標記反應的效率比較高。如果蛋白溶液的緩沖范圍在低pH,加入重碳酸鹽也無法將pH調節至**適水平。要么加大重碳酸鹽的量,要么將緩沖液換成PBS,或用0.1M碳酸氫鈉透析等。4)研究顯示pH升至9.0~9.4,標記效率和標記速度(只需10min)明顯改善。5)不同抗體與熒光團的反應速率不同,染料標記后保留的生物活性程度也不同,因此標準步驟也不是總有比較好的標記結果。為增加標記率,可以對同一樣品進行再標記,或減少蛋白的量加大染料的量重新標記。有研究者在室溫孵育1小時后再4℃孵育過夜,情況有所改善。羅丹明具有出色的光穩定性以及許多光物理特性,使其非常適合用作激光染料、熒光探針和顏料。海南ivis熒光染料
D-熒光素(D-Luciferin)是螢火熒光素酶底物,其量子效率為0.88,是Luminol的20倍。免疫組化熒光染料luc
管可用于實驗室的熒光團數量眾多,但這些染料通常屬于以下三組之一:熒光染料:這些是用于在體外標記生物相關分子的小型有機天然或合成熒光分子。該組中的一些熒光染料包括熒光素、溴化乙錠和花青。熒光蛋白:這些是較大的、生物制造的蛋白質,由于它們的大分子結構而發出熒光。GFP、RFP和YFP是屬于該組的一些染料。量子點:這些高熒光合成納米晶體由半導體材料制成。隨著熒光基本特性的廣泛應用和該領域的顯著進步,已經針對特定應用和儀器開發和優化了數百種活性熒光染料。同樣,多年來,大量復雜的熒光技術(例如,FRET、TRF、FP、FRAP、FACS、FCS)也在不斷發展。免疫組化熒光染料luc